復(fù)旦學(xué)者在《細(xì)胞》（Cell）刊發(fā)最新研究成果，陸路、孫蕾、姜世勃團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)防治冠狀病毒的新靶點，并設(shè)計出高效雙功能抗病毒藥物。
2025年1月30日，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院陸路研究員、孫蕾研究員、姜世勃教授團(tuán)隊合作在《細(xì)胞》雜志以Research Article的形式在線發(fā)表了題為“Early fusion intermediate of ACE2-using coronavirus spike acting as antiviral target”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)了ACE2受體誘導(dǎo)的冠狀病毒刺突蛋白早期融合中間態(tài)構(gòu)象（E-FIC），并針對該中間態(tài)構(gòu)象設(shè)計了高效、廣譜、兼具失活病毒和抑制病毒感染的雙功能抗冠狀病毒候選藥物。
1月30日，Cell《細(xì)胞》刊發(fā)的復(fù)旦學(xué)者陸路/孫蕾/姜世勃團(tuán)隊研究成果。本文圖片均為復(fù)旦上醫(yī)供圖
解密ACE2受體誘導(dǎo)的冠狀病毒刺突蛋白早期融合中間態(tài)構(gòu)象
在包膜病毒入侵宿主細(xì)胞的過程中，一些病毒能夠借助其表面蛋白介導(dǎo)其包膜與宿主細(xì)胞膜融合，進(jìn)而將遺傳物質(zhì)注入細(xì)胞開啟感染進(jìn)程。膜融合是病毒建立感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。
近年來，眾多研究團(tuán)隊成功揭示了SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2以及其他一些冠狀病毒S蛋白的RBD與受體結(jié)合的復(fù)合物構(gòu)象，以及S蛋白三聚體與受體結(jié)合的融合前構(gòu)象。姜世勃、陸路等研究團(tuán)隊也發(fā)現(xiàn)了MERS-CoV（Nature Communications 2014）、SARS-CoV-2（Cell Research 2020）等S蛋白HR1/HR2形成六螺旋的融合后構(gòu)象。
但目前仍有一個關(guān)鍵問題尚未明確——刺突蛋白從融合前狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿诤虾鬆顟B(tài)時，究竟經(jīng)歷了怎樣的構(gòu)象變化。雖然已有研究者發(fā)現(xiàn)新冠病毒S2亞基中間態(tài)構(gòu)象，但是對于早期的融合中間態(tài)，特別是介于受體結(jié)合和S1亞基脫落之間的S蛋白構(gòu)象是否存在，及其變構(gòu)細(xì)節(jié)等還一直處于認(rèn)知盲區(qū)。
此次，上述團(tuán)隊首先利用流式細(xì)胞術(shù)，發(fā)現(xiàn)跨膜表達(dá)的S蛋白在受到ACE2蛋白胞外域的刺激后，能夠結(jié)合HR1抗體或其配體多肽EK1，而此時S1亞基還沒有脫落，提示可能存在一種不同于傳統(tǒng)觀點的早期融合中間態(tài)構(gòu)象。為了捕獲并直觀地呈現(xiàn)S蛋白的這種中間態(tài)構(gòu)象，研究團(tuán)隊對S蛋白與ACE2胞外域共孵育產(chǎn)物進(jìn)行冷凍電鏡顆粒篩選。通過長時間的摸索，研究者成功發(fā)現(xiàn)并解析了一種高分辨率（3.45 ?）的早期融合中間態(tài)構(gòu)象（E-FIC）。
在E-FIC中，S2亞基發(fā)生了構(gòu)象轉(zhuǎn)變，其中HR1三螺旋結(jié)構(gòu)彈出，而S1亞基組成環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合在S2亞基的底部。通過進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和分析，研究者發(fā)現(xiàn)在E-FIC S2亞基的HR1上結(jié)合著一段氨基酸序列，將其命名為中間態(tài)環(huán)——IL770。值得注意的是，S2’位點就位于IL770中，且突出于結(jié)合表面形成隆起，這種結(jié)構(gòu)特征有利于蛋白酶的切割。
此外，通過上述構(gòu)象可以推測蛋白酶對S2’位點的切割可能觸發(fā)IL770從HR1表面剝脫，從而釋放空間以利于HR2結(jié)合。通過對融合前和E-FIC結(jié)構(gòu)的對比分析，研究者進(jìn)而發(fā)現(xiàn)S蛋白結(jié)合ACE2受體后，S1亞基和S2亞基底部均會向細(xì)胞膜方向旋轉(zhuǎn)以實現(xiàn)病毒膜和細(xì)胞膜初步拉近，這將有助于縮短融膜肽插入細(xì)胞膜所需的距離。
SARS-CoV-2 S蛋白在誘導(dǎo)膜融合過程中經(jīng)歷的構(gòu)象變化。
設(shè)計高效雙功能抗病毒候選藥物
通過對E-FIC結(jié)構(gòu)的分析，研究者還發(fā)現(xiàn)S1亞基中的RBD與S2亞基中的HR1之間的空間距離被拉近，這一發(fā)現(xiàn)也為靶向該中間體的藥物設(shè)計提供了新思路。
E-FIC中RBD與HR1之間的空間距離拉近。
基于此構(gòu)象，研究者選用了經(jīng)臨床試驗證明具有較好活性和安全性的RBD結(jié)合藥物候選（ACE2蛋白）和HR1的結(jié)合藥物候選（EK1多肽），設(shè)計出雙功能域串聯(lián)藥物候選。
由于E-FIC結(jié)構(gòu)中HR1表面被IL770所結(jié)合，研究者通過競爭性結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)，EK1多肽能夠憑借強大的相互作用從IL770中奪取HR1進(jìn)行結(jié)合。隨后，為了驗證雙功能域之間最佳連接子長度，研究者通過表達(dá)含有2、5、6、7組連接子的蛋白進(jìn)行活性篩選，發(fā)現(xiàn)由 5組連接子串聯(lián)的蛋白（AL5E）具有最佳靶點結(jié)合活性和廣譜性。
后續(xù)研究結(jié)果表明，上述設(shè)計的蛋白類抗病毒活性分子具有失活病毒和抑制病毒雙功能。
一是從失活病毒功能方面看，AL5E蛋白上的ACE2功能域誘導(dǎo)游離病毒表面的S蛋白形成融合中間態(tài)，該中間態(tài)暴露出靠近ACE2的HR1區(qū)，隨后AL5E蛋白中的EK1功能域與HR1三聚體結(jié)合，造成病毒S蛋白鎖定在融合中間態(tài)，使該病毒粒子喪失感染活性。
二是從抑制病毒功能方面看，AL5E蛋白上的ACE2功能域和EK1功能域也可分別作為抑制劑，抑制病毒對靶細(xì)胞的感染。AL5E對新冠病毒及其變異株的抑制活性比ACE2蛋白提高26至623倍，對游離病毒的失活活性提高21至754倍。此外，AL5E對其他使用ACE2受體的冠狀病毒均具有很好的抗病毒效果。
同時，為了進(jìn)一步探究所設(shè)計的雙功能分子在體內(nèi)的活性。研究團(tuán)隊借助新冠病毒變異株BA.5.2和人冠狀病毒NL63感染小鼠的模型，分別對AL5E蛋白在病毒感染治療和病毒失活方面的效果展開了評估。結(jié)果顯示，AL5E能夠顯著降低小鼠肺臟中病毒載量。
研究圖示
這些研究不僅揭示了冠狀病毒S蛋白在膜融合早期階段經(jīng)歷的構(gòu)象變化細(xì)節(jié)，還發(fā)現(xiàn)了其中的一些潛在藥物靶點，為深入探索冠狀病毒的膜融合機制及開發(fā)新型靶向性廣譜藥物或疫苗提供了新的思路。
復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院陸路研究員、孫蕾研究員和姜世勃教授為本文的共同通訊作者；邢立曉博士后、劉治民博士、王欣玲青年研究員和劉倩瑩博士為本文共同第一作者。
（原標(biāo)題 復(fù)旦學(xué)者Cell發(fā)文：發(fā)現(xiàn)防治冠狀病毒新靶點并設(shè)計了雙功能抗病毒候選藥物）
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