過氧化氫酶是一種普遍存在于自然界的血紅素鐵酶，其活性主要是分解H2O2產(chǎn)生H2O和O2，以保護生物體不被過氧化氫所毒害，目前該酶的主要研究方向為H2O2的分解機制及其生理功能，而過氧化氫酶的O2的代謝利用機制尚未見報道。前期研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶EasC利用O2催化麥角生物堿核心骨架四并環(huán)結(jié)構(gòu)中C環(huán)合成時并不需要額外添加NADPH等還原劑，推測其可能代表著一種未知的氧氣激活與氧同化機制。
近日，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所高書山團隊與杭州師范大學(xué)郭瑞庭團隊合作，破解了EasC蛋白底物復(fù)合體結(jié)構(gòu)，并利用波譜測定、體外生化、同位素標(biāo)記和化學(xué)計算等手段，從分子水平闡明了EasC利用O2催化氧化環(huán)化反應(yīng)的新機制。團隊首先通過電鏡獲得EasC酶與底物PCC的復(fù)合體結(jié)構(gòu)（2.33 ?），發(fā)現(xiàn)EasC呈現(xiàn)二聚體結(jié)構(gòu)，并且發(fā)現(xiàn)PCC并不是結(jié)合在heme口袋上方，而是結(jié)合在過氧化氫酶共有的NADPH口袋，該位置距離heme口袋20.7 ?，兩口袋之間通過一個狹長活性氧傳輸通道相連。為了探究EasC參與催化反應(yīng)的鐵氧復(fù)合物類型，隨后團隊對酶的波譜特征進行了檢測。在有氧條件下，將底物PCC和EasC酶（靜息態(tài)Fe(III)）進行快速混合，使用停留色譜檢測到了416、544 和590 nm的最大吸收，該吸收明顯區(qū)別于血紅素酶已報道的鐵-氧復(fù)合體Compound I (Cpd I,Fe(IV)=O) 的最大吸收（408 和650 nm），反而與文獻報道的Compound III(Cpd III,Fe(III)-O2·-）吸收一致，表明EasC中的血紅素鐵可能以Cpd III的方式參與催化反應(yīng)。進一步的電子順磁共振和紫外吸收測試表明，在有氧條件下，靜息態(tài)EasC的Fe(III)接收底物電子并與O2結(jié)合耦合、直接形成Cpd III。由于Cpd III可以分解生成超氧陰離子（O2·-）并回歸到靜息態(tài)Fe(III)，團隊推測EasC催化過程可能由超氧陰離子介導(dǎo)。因此該研究進一步通過活性氧抑制實驗、超氧陰離子恢復(fù)實驗以及18O標(biāo)記的超氧陰離子自由基競爭性實驗，鑒定出氧氣被活化成超氧陰離子（O2·-）的活性氧形式、參與底物的轉(zhuǎn)化，而非傳統(tǒng)的鐵-氧復(fù)合物轉(zhuǎn)化底物。
基于以上實驗結(jié)果，團隊提出了基于活性氧超氧陰離子的反應(yīng)機制：i)結(jié)合在NADPH口袋的底物PCC，其吲哚氨基將一個電子傳遞給血紅素口袋的Fe(III)，后者同時和氧氣結(jié)合形成Fe(III)-O2·- (Cpd III)；ii)Cpd III進一步分解成Fe(III)和超氧陰離子（O2·-），生成的超氧陰離子通過兩個口袋之間的ROS通道進入NADPH口袋；iii)超氧陰離子與底物PCC結(jié)合，催化復(fù)雜的氧化環(huán)化反應(yīng)，完成麥角生物堿C環(huán)的合成。
綜上所述，該研究詳細闡明了麥角生物堿核心骨架C環(huán)的生物合成機制，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶EasC利用超氧陰離子實現(xiàn)氧氣激活，并進一步催化氧化環(huán)化反應(yīng)。該機制代表了一種全新的血紅素金屬酶的催化模式，即氧氣無需形成活性鐵-氧復(fù)合物。同時，該研究也讓過氧化氫酶的相關(guān)研究從H2O2依賴性酶轉(zhuǎn)向O2依賴性酶，拓展了過氧化氫酶這一生物催化劑的研究領(lǐng)域。
該工作得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動、湖北紅山實驗室項目、杭州師范大學(xué)交叉學(xué)科研究項目以及中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項等項目支持，相關(guān)成果發(fā)表于Nature期刊。杭州師范大學(xué)陳純琪教授、博士生劉紫薇，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所客座博士生禹之璞、中國科學(xué)院微生物研究所副研究員姚永鵬為本文的共同第一作者，高書山研究員和郭瑞庭研究員為本文的共同通訊作者。低碳合成工程生物學(xué)全國重點實驗室和工業(yè)酶國家工程研究中心相關(guān)科研人員在本項工作中做出了重要貢獻。
論文鏈接
超氧陰離子（O2·-）催化麥角生物堿C環(huán)的合成機制
過氧化氫酶生成超氧陰離子催化麥角堿天然藥物分子生物合成示意圖 專家點評：
趙國屏（中國科學(xué)院院士，中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點實驗室專家委員會主任）
超氧陰離子（O?·?）是在細胞代謝中產(chǎn)生的一種活性氧自由基，通常認為它具有損傷DNA、蛋白質(zhì)等生物毒性功能。另一方面，超氧陰離子在化學(xué)合成中已經(jīng)作為一種化學(xué)催化劑廣泛用于有機分子合成；那么，超氧陰離子是否可能在生物催化、生物合成中發(fā)揮作用，尚未得到揭示。近期，高書山課題組和郭瑞庭課題組合作，在體外催化實驗中發(fā)現(xiàn)超氧陰離子參與天然產(chǎn)物分子的生物合成，并解析其機制；這一新的認識，突破了超氧陰離子現(xiàn)有的毒性功能認知。
在此項研究中，研究者綜合結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)、同位素化學(xué)以及波譜學(xué)實驗，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶EasC可以利用麥角生物堿底物提供的一個電子，在血紅素口袋直接將氧氣還原成超氧陰離子；后者可以進一步通過超氧陰離子傳遞通道，輸送至位于蛋白表面的底物反應(yīng)位點，催化復(fù)雜、多步的自由基反應(yīng)，合成麥角生物堿天然產(chǎn)物分子。文章進一步指出，這種由活性氧介導(dǎo)的生物催化機制極可能普遍存在于自然界，是一種普遍存在的金屬酶催化機制。因此，本研究不僅解析了過氧化氫酶EasC的一種特別有趣的前所未知的催化機制，更重要的是界定了超氧陰離子的生物催化功能。它向人們揭示了超氧陰離子在生命活動中的雙重功能特性，即既是細胞代謝中不可避免會產(chǎn)生的具有毒性的副產(chǎn)物，又可能在生物合成過程中成為催化工具、參與天然產(chǎn)物合成；從而提示人們應(yīng)全面認識超氧陰離子的作用，并根據(jù)不同的應(yīng)用場景，注意恰當(dāng)?shù)姆雷o或利用。
鄧子新（中國科學(xué)院院士，上海交通大學(xué)微生物代謝全國重點實驗室主任）
在微生物細胞內(nèi)，O2需要在氧化酶/加氧酶的激活下，作為親電試劑通過酶促反應(yīng)整合至代謝產(chǎn)物的含氧官能團（如羥基、羰基等）中、產(chǎn)生特定生物功能的結(jié)構(gòu)單元。常見的氧化酶O2激活路徑為：酶結(jié)構(gòu)中的有機輔酶或金屬輔因子利用還原劑的電子還原O2、形成輔酶-O復(fù)合體/輔因子-O復(fù)合體；上述復(fù)合體進一步來催化底物的氧化/加氧等生物化學(xué)反應(yīng)。這一典型O2激活路徑被學(xué)術(shù)界廣泛認可，在教科書中關(guān)于酶的催化機制闡釋中被廣泛引用。
高書山課題組和郭瑞庭課題組合作，圍繞真菌天然藥物麥角生物堿合成酶EasC的生物催化機制解析，捕獲到一種新O2活化機制。該機制由三部分組成，第一，底物直接為血紅素Fe(III)供電子，徹底擺脫對NADPH的依賴；第二，通過Fe(III)-O?·?中間體的瞬時生成，將危險的超氧陰離子（O?·?）轉(zhuǎn)化為可控的催化"手術(shù)刀"；第三，疏水傳輸通道確?；钚匝醴肿泳珳蕦?dǎo)航至底物反應(yīng)位點。此種O2激活模式下的EasC酶利用超氧陰離子作為自由擴散型催化工具，成功解耦過氧化氫酶生化反應(yīng)的空間限域性。
這種基于超氧陰離子的O2激活模式突破了傳統(tǒng)酶促氧代謝的輔酶-O/輔因子-O等復(fù)合體催化理論框架。這一發(fā)現(xiàn)證明了自然界血紅素酶等金屬酶催化的功能和機制的多樣性，為人工設(shè)計高效生物催化劑開辟全新路徑，在生物制藥、綠色化工等領(lǐng)域具有重大應(yīng)用潛力。
李盛英（山東大學(xué)教授）
血紅素酶是自然界中含量最豐富且功能最多樣的生物催化劑之一，其介導(dǎo)的氧化反應(yīng)在細胞外源物降解、代謝產(chǎn)物生物合成中發(fā)揮著核心關(guān)鍵作用。由于大氣中的O?分子處于熱力學(xué)穩(wěn)定態(tài)，其直接參與生物合成反應(yīng)存在顯著動力學(xué)勢壘，因此對于血紅素酶催化的氧化反應(yīng)過程可以分為兩個階段：O2激活和底物轉(zhuǎn)化。在NADPH提供電子的前提下，酶通過血紅素鐵激活還原O2，形成Fe-O復(fù)合物（Compound I/II/III），進而轉(zhuǎn)化底物。這種鐵-O復(fù)合物模式要求底物結(jié)合于血紅素上方，且氧氣激活與底物轉(zhuǎn)化發(fā)生在同一口袋，這種"面對面"的工作模式，嚴重限制了復(fù)雜分子的合成空間。
近期，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所高書山團隊與杭州師范大學(xué)郭瑞庭團隊在《自然》發(fā)表的成果揭示了一種雙口袋、遠程協(xié)同催化模式。在該研究中，高書山團隊和郭瑞庭團隊合作，通過冷凍電鏡解析了麥角生物堿合成酶EasC的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)麥角生物堿底物結(jié)合于NADPH口袋而非傳統(tǒng)血紅素口袋，并通過一個狹長的疏水隧道實現(xiàn)血紅素口袋與底物口袋的協(xié)同催化。通過停流光譜、EPR以及紫外-可見光譜等技術(shù)證實了血紅素-鐵的Compound III（Cpd III）中間體的存在，并創(chuàng)新性地提出Cpd III可以分解生成超氧陰離子（O?·?），后者通過隧道傳遞介導(dǎo)麥角生物堿C環(huán)形成的自由基級聯(lián)反應(yīng)。
這種機制相當(dāng)于在針尖上建起兩座不同化工廠，分別生產(chǎn)活性氧和藥物分子，并通過分子級"特快專列"傳遞催化指令。在該機制中，底物無需直接接觸Fe中心與O2，O2激活與底物轉(zhuǎn)化分別在獨立區(qū)域完成。這種空間分離不僅顯著擴展了底物轉(zhuǎn)化的三維空間，還實現(xiàn)了多步自由基氧化環(huán)化反應(yīng)的精準調(diào)控。因此，該研究發(fā)現(xiàn)突破了血紅素酶傳統(tǒng)的Fe-氧復(fù)合物催化范式，為自然界廣泛存在的血紅素酶催化機制研究提供了新視角。
陳義華（中國科學(xué)院微生物研究所研究員，微生物資源與生物技術(shù)研究室主任）
微生物次級代謝蘊藏了豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性，是抗生素、抗癌藥物、免疫調(diào)節(jié)劑等藥物分子的重要來源。為了合成結(jié)構(gòu)各異的次級代謝產(chǎn)物，微生物進化出了突出的酶催化元件多樣性。對微生物藥物分子的生物合成研究有效拓展了酶催化機制的認知邊界，為開發(fā)新型酶元件和發(fā)展合成生物學(xué)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
高書山團隊前期在對麥角生物堿類藥物的研究中發(fā)現(xiàn)了特殊的過氧化氫酶EasC，它可以催化裸麥角堿C環(huán)的形成。在Nature最新發(fā)表的工作中，他們和郭瑞庭團隊合作進一步揭示了EasC的獨特催化機制，拓展了對氧化酶催化機制的認知邊界。EasC突破了經(jīng)典過氧化氫酶僅催化H?O?歧化的功能局限，進化出了一種前所未知的超氧陰離子（O?·-）介導(dǎo)的協(xié)同催化機制，催化形成了裸麥角堿的C環(huán)。
EasC對氧化還原酶經(jīng)典催化機制的挑戰(zhàn)在于：它并非利用活性的血紅素Fe-O復(fù)合物來催化反應(yīng)，而是在血紅素活化區(qū)分解血紅素Fe和氧氣形成的Compound III產(chǎn)生超氧陰離子，通過11.6?的疏水隧道擴散至底物轉(zhuǎn)化區(qū)完成裸麥角堿的氧化環(huán)合。這種"自由基穿梭"機制為理解金屬酶催化中的電子-活性氧協(xié)同傳遞催化提供了全新的視角。更有意思的是，EasC采用的"雙位點-隧道協(xié)同"的催化架構(gòu)展現(xiàn)了微生物在利用有限的氧活化反應(yīng)類型的基礎(chǔ)上，進化出的催化智慧：通過血紅素在活化區(qū)產(chǎn)生活性氧物種（ROS），在空間解耦的底物轉(zhuǎn)化區(qū)完成催化。將ROS的生成與利用進行空間區(qū)室化，既避免了細胞毒性，又高效完成了氧化反應(yīng)，展現(xiàn)了酶對多步自由基級聯(lián)反應(yīng)的精準時空調(diào)控。
微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成研究的突破不斷刷新我們對生物催化的認知。不管是前期發(fā)現(xiàn)的不依賴任何輔基的氧化酶、不同類型的鹵化酶、Diels–Alder環(huán)化酶，還是該研究揭示的新型過氧化氫酶，都為認識生物催化的多樣性、開發(fā)新型生物催化劑、重構(gòu)藥物分子生物合成途徑提供了寶貴的資源。
（原標(biāo)題：天津工業(yè)生物技術(shù)研究所等發(fā)現(xiàn)一種基于超氧陰離子的過氧化氫酶催化機制）
本文鏈接：http://www.enbeike.cn/news-8-2450-0.html我國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)基于超氧陰離子的過氧化氫酶催化機制
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